[]
gen klonlamasını detaylı anlatacak insan aranıyor
dersi sik gibi anlatan bir hocamız var. konu restriction enzimini kullanmak, gen klonlaması, pcr.
step step bizden bunun nasıl olduğunu istiyor fakat verdiği az bilgiyle ben bunun içinden çıkamıyorum.
çok olmayacak bir şey istediğimin farkındayım ama belki bir ihtimal diye şansımı deneyeyim dedim.
konuya vakıf birileri anlatırsa, benle iletişirse çok güzel olur. "google it biç" demeyiniz, müşkül durumdayım.
step step bizden bunun nasıl olduğunu istiyor fakat verdiği az bilgiyle ben bunun içinden çıkamıyorum.
çok olmayacak bir şey istediğimin farkındayım ama belki bir ihtimal diye şansımı deneyeyim dedim.
konuya vakıf birileri anlatırsa, benle iletişirse çok güzel olur. "google it biç" demeyiniz, müşkül durumdayım.
gen diyince nedense aklima hep gülben er gen gelmistir
- maresalx
(24.10.12 16:24:55)
akşam vaktim olursa anlatayım. türkçe mi eğitim görüyosun?
- meriadoc (24.10.12 17:06:24)
hiç fark etmez her türlüsüne ihtiyacım var. ingilizce görüyorum ama türkçe de olur yani.
- svpam
(24.10.12 17:23:01)
şimdi elinde bir gen dizisi ve bir vektör olduğunu varsayalım. bu geni başka bir vektörden kesebilirsin restriction enzimi kullanarak ya da elinde sentezlenmiş bir oligopeptide olabilir.
pcr da dediğine göre şöyle yapıcaz:
öncelikle kullanmak istediğin vektörü belirleyeceksin. o vektörde geni sokmak istediğin yere göre restriction sitelar olacak, senin elindeki gene bu siteları eklemen gerek. gen için forward ve reverse primer design edeceksin, ama primerlerin sonuna bu restriction siteları da ekleyeceksin ki genin:
RS1--gen--RS2 şeklinde olsun. sonra bu primerleri kullanarak RS eklenmiş genini kaynağından pcrla çoğaltacaksın. sonra pcrla çoğalttığın kısmı bir takım kitler kullanarak temiz hale getireceksin. (pcr cleanup kit)
elinde şimdi restriction siteları olan bir gen var, sıra geldi bunu vektöre sokmaya.
vektörü ve geni istediğin enzimlerle keseceksin, (hani restriction enzimleri palindromik ya genelde, bu şekilde sticky ya da blunt end elde edeceksin)
kestiğin vektörü kontrol etmek için istersen önce agarose jelde yürütüp sonra oradan tekrar uygun kbdaki dnayı jelden geri extract edip yine temizleyeceksin. (gel extraction kit)
elinde restriction enzimleriyle kesilmiş bir adet gen ve linearized vektör var. bu noktada elindeki dna miktarını hesaplayıp ona göre ligation yapman lazım. ligation sonuçlandığında elinde istediğin geni bulunduran bir vektör olacak. kontrol için bu vektörü tekrar aynı enzimlerle kesip bakabilirsin.
sonra, bu vektörü uygun bir bakteriye vs aktarman gerek. bakteriyi competent hale getirecek birçok yöntem var, bunlardan birini seçerek vektörü bakteriye aktaracaksın. genelde vektörde seçmek için bir marker bulunur; mesela bakteri His- dır vektör His+dır, transformation olmuşsa bakteri His- mediada yaşayabilir. transforme ettikten sonra bakacaksın, koloni büyümüş mü? büyüdüyse birkaç koloni seçip sekanslamaya göndereceksin, sekans sonuçları doğruysa tebrikler klonlaman çalışmış demektir.
biraz türkçe ingilizce oldu ama :) kolay gelsin
pcr da dediğine göre şöyle yapıcaz:
öncelikle kullanmak istediğin vektörü belirleyeceksin. o vektörde geni sokmak istediğin yere göre restriction sitelar olacak, senin elindeki gene bu siteları eklemen gerek. gen için forward ve reverse primer design edeceksin, ama primerlerin sonuna bu restriction siteları da ekleyeceksin ki genin:
RS1--gen--RS2 şeklinde olsun. sonra bu primerleri kullanarak RS eklenmiş genini kaynağından pcrla çoğaltacaksın. sonra pcrla çoğalttığın kısmı bir takım kitler kullanarak temiz hale getireceksin. (pcr cleanup kit)
elinde şimdi restriction siteları olan bir gen var, sıra geldi bunu vektöre sokmaya.
vektörü ve geni istediğin enzimlerle keseceksin, (hani restriction enzimleri palindromik ya genelde, bu şekilde sticky ya da blunt end elde edeceksin)
kestiğin vektörü kontrol etmek için istersen önce agarose jelde yürütüp sonra oradan tekrar uygun kbdaki dnayı jelden geri extract edip yine temizleyeceksin. (gel extraction kit)
elinde restriction enzimleriyle kesilmiş bir adet gen ve linearized vektör var. bu noktada elindeki dna miktarını hesaplayıp ona göre ligation yapman lazım. ligation sonuçlandığında elinde istediğin geni bulunduran bir vektör olacak. kontrol için bu vektörü tekrar aynı enzimlerle kesip bakabilirsin.
sonra, bu vektörü uygun bir bakteriye vs aktarman gerek. bakteriyi competent hale getirecek birçok yöntem var, bunlardan birini seçerek vektörü bakteriye aktaracaksın. genelde vektörde seçmek için bir marker bulunur; mesela bakteri His- dır vektör His+dır, transformation olmuşsa bakteri His- mediada yaşayabilir. transforme ettikten sonra bakacaksın, koloni büyümüş mü? büyüdüyse birkaç koloni seçip sekanslamaya göndereceksin, sekans sonuçları doğruysa tebrikler klonlaman çalışmış demektir.
biraz türkçe ingilizce oldu ama :) kolay gelsin
- meriadoc (24.10.12 19:17:52)
1
